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基因敲入细胞
基因定点敲入（KI，gene knock in）技术是指在细胞基因组特定位点精准敲入外源基因序列，使其在细胞内稳定表达的一种基因编辑技术。
▍ 技术原理：
DNA双链断裂（DSB）是基因敲入的关键步骤，这一损伤会触发细胞中的两种DNA修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。基因敲入技术的核心是gRNA或crRNA引导Cas酶切割目标位点的DNA双链，细胞利用外源提供的Donor为模板，基于HDR或NHEJ机制将目标基因序列精确地敲入到基因组的特定位置。
| 技术类型 | 效率 | 优点 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| CRISPR/HDR | 5-30% | 灵活性高，支持点突变和片段插入 | 分裂较活跃细胞 |
| CRISPaint | 20-50% | 不依赖细胞周期 | 分裂周期长的细胞 |
| Bingo™ | 30-80% | 无DSB或供体模板，脱靶风险低 | 精准敲入小片段或点突变修复 |
| HES-KI | 40%-90% | 独特筛选机制介导高效敲入 | 重要基因位点C端敲入 |
● 工业生产：目的基因表达高稳定性和均一性，保障了产品大规模生产的产量和质量。 ● 基因治疗：确保细胞治疗中治疗性基因的稳定整合。 ● 干细胞工程：在IPSC中实现了高效率的转基因敲入。 ● 功能基因组学：筛选必需基因的功能域或调控元件。 ● 疾病建模：构建符合生理表达水平的基因修饰细胞系。
服务详情
| 细胞类型 | 肿瘤细胞、干细胞等各类细胞，点击查看全部细胞系列表 |
|---|---|
| 服务类型 | 荧光蛋白定点敲入（EFGP、Luc、mCherry等）/ 标签蛋白定点敲入（Flag、HA、Myc、HiBiT等）/ 特定位点敲入 / 基因点突变 |
| 交付标准 | 基因敲入单克隆细胞1株（2管细胞，1×10^6/管） |
| 周期/价格 |
 在线咨询 |
HES-KI技术
HES-KI技术原理
HES-KI（重要基因位点敲入）是一种新型的敲入技术，顺利获得在重要基因的C端外显子区域进行CRISPR编辑，并设计一个转基因敲入模板，使得成功敲入的细胞能够恢复重要基因的功能，同时整合敲入的基因序列；如果未成功敲入细胞，如NHEJ介导的有插入或缺失（indels）的细胞，将导致重要基因功能丧失，使细胞无法存活，从而实现对成功敲入细胞的富集。
HES-KI技术优势
高效率
稳定且均一
多基因整合
调控能力强
HES-KI成功案例
• 使用HES-KI技术在K562细胞GAPDH中敲入EGFP，未使用抗性筛选情况下多克隆的敲入效率达到37%
• K562 EGFP-KI细胞和WT细胞单克隆细胞株倍增时间差异不显著，EGFP插入后不影响K562细胞生长。
| K562 EGFP-KI 多克隆 | |
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| K562 EGFP-KI 单克隆 | |
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• 使用HES-KI技术，293T多克隆细胞中，EGFP的敲入效率达到68%。在CHO-K1多克隆细胞中，EGFP的敲入效率达到55%。
• 293T和CHO-K1 EGFP-KI多克隆细胞图片
| 293T | CHO-K1 |
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CRISPaint基因敲入
CRISPaint技术原理
CRISPaint是一种基于CRISPR-Cas9系统的基因敲入技术，顺利获得利用细胞自身的非同源末端连接（NHEJ）修复机制，能够在指定的基因C端位置敲入外源DNA片段，无需依赖同源重组（HDR）。CRISPaint的设计具有高度的灵活性，适用于多种基因功能研究和基因组编辑应用。1、CRISPR-Cas9引导的双链断裂（DSB）
Target sgRNA质粒：切割基因特定位置，导致DNA双链断裂，激活细胞的DNA修复机制。
2、通用Donor载体设计
CRISPaint使用一种通用的供体DNA模板，顺利获得以下组分实现CRISPaint系统灵活的敲入策略：
Frame sgRNA质粒：切割Donor质粒，在细胞内形成线性化模版；有3种Frame-sgRNA可供选择，保证敲入基因正确OFR序列表达。
通用Donor质粒：包含待插入的基因序列（如荧光蛋白）和3种Donor-sgRNA的靶点序列。
3、非同源末端连接（NHEJ）
靶点基因形成DSB和Donor被切割，细胞顺利获得NHEJ修复机制，将线性化的Donor模版整合至DSB位置，实现了高效的基因敲入。
CRISPaint技术优势
高效性
适用范围广
灵活性
CRISPaint实验流程
CRISPaint成功案例
• Sanger测序验证Neo精确敲入至H9细胞A基因C端
Bingo™介导基因敲入
Bingo™技术原理
Bingo™ 是一种基于Prime Editing介导小片段敲入的基因编辑技术，能够在不依赖DNA双链断裂的情况下，实现对目标基因的精准编辑。该技术的核心在于使用融合了逆转录酶的Cas9 nickase（Cas9n-RT），在pegRNA引导下识别编辑位点，顺利获得Cas9n在编辑位点产生单链切口，逆转录酶利用pegRNA的模板序列在单链切口位置合成新的DNA序列，从而实现精准的基因敲入。
Bingo™技术优势
更安全
高精确性
多功能性
Bingo™实验流程
Bingo™应用案例
| 细胞名称 | HCT116 |
|---|---|
| 基因 | EGFR（Gene ID: 1956） |
| 突变位点 | c.2319_2320 ins CAC |
SpacerGCCCAGCAGGCGGCACACGTG
| Bingo™ pegRNA | Spacer | GCCCAGCAGGCGGCACACGTG |
|---|---|---|
| Extension | GTGGACAACCCCCACcacGTGTGCCGC | |
| Bingo™ gRNA | GCACcacGTGTGCCGCCTGCT | |
• HCT116细胞EGFR基因敲入（c.2319_2320 ins CAC）多克隆细胞测序结果
CRISPR/HDR基因敲入
CRISPR/HDR技术原理
CRISPR/HDR是一种依靠CRISPR系统和细胞HDR修复机制实现基因敲入的基因编辑技术。sgRNA识别并结合目标基因位点，在Cas9核酸酶的作用下切割DNA双链，含同源臂的DNA供体模板在细胞HDR修复机制的作用下，整合至sgRNA切割位点中，实现精确的基因敲入。
CRISPR/HDR技术优势
灵活性高
精准度高
CRISPR/HDR技术流程
Advantage and Characteristic
Optimazied Strategy
Optimazied Strategy
Optimazied Strategy
Optimazied Strategy
参考文献
顺利获得同步细胞周期来增强CRISPR介导的同源重组修复（HDR）效率
该研究探讨了顺利获得同步细胞周期来增强CRISPR介导的同源重组修复（HDR）效率的方法。使用小分子调节细胞周期，在各种细胞系中实现了1.2-1.5倍的KI效率提高。研究还展示了该方法在动物胚胎中的应用，显著提高了猪胚胎中的KI频率。这一方法顺利获得调节细胞进入有利于HDR的周期阶段，从而提高了基因敲入的成功率，为CRISPR基因编辑提供了新的优化策略。
基于CLASH技术的基因敲入策略
CLASH（Cas9-Linked Adaptor Synthesis for Homology-directed repair）技术能够在大规模细胞工程中实现高效的基因敲入。该方法结合了Cas9蛋白和适配子合成，使得在多种细胞类型中进行平行敲入成为可能。顺利获得在DNA修复过程中提供特定的适配子来提高同源重组修复（HDR）的效率，从而大大提升基因敲入的成功率。该技术展示了在细胞工程和基因编辑中的巨大潜力，特别是在需要多基因修改的复杂生物工程应用中。
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